自動化多肽合成儀操作全流程解析：從樹脂選擇到產物純化的關鍵步驟
 

　　一、樹脂選擇：奠定合成基礎
 

　　樹脂是固相合成的核心載體，其類型直接影響多肽的溶脹性、疏水性及最終產物結構。
 

　　聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂(Wang樹脂)
 

　　特點：網格空間大，適合長肽鏈合成；化學穩定性高，可通過中等酸(如TFA)處理釋放多肽。
 

　　適用場景：常規多肽合成，尤其需C端羧酸結構的多肽。
 

　　Rink Amide樹脂
 

　　特點：支持C端酰胺化，適合合成酰胺鍵結尾的多肽。
 

　　優勢：兼容性廣，減少副反應風險。
 

　　PEG-PS樹脂
 

　　特點：溶脹性優異，可降低空間位阻，提升疏水性多肽的合成效率。
 

　　案例：合成含連續疏水氨基酸(如Leu、Phe)的多肽時，PEG-PS樹脂可顯著提高粗純度。
 

　　選擇依據：根據目標多肽的C端結構(羧酸/酰胺)、序列長度及疏水性綜合評估。例如，含Cys、His等敏感氨基酸的多肽需選擇酸敏感性樹脂(如2-氯三甲苯樹脂)，以避免側鏈副反應。
 

　　二、設備準備與校準：確保精準控制
 

　　設備檢查
 

　　確認溶劑儲液瓶、氣體管道連接完好，儀器各部件無損壞。
 

　　檢查壓力范圍：壓縮空氣(AIR)需在60-100psi，氮氣(N2)在5-10psi。
 

　　系統校準
 

　　執行溫度、條形碼、反應器攪拌、取液針、氨基酸推瓶等測試。
 

　　校準UV檢測模塊，確保脫保護效率監測準確。
 

　　反應容器選擇
 

　　根據合成規模(如20-50μmol)選擇合適容器，避免溶劑與容器材料反應。
 

　　案例：某實驗室因未校準UV模塊，導致脫保護效率監測偏差，最終多肽缺失率達15%；校準后缺失率降至3%。
 

　　三、合成步驟：脫保護、偶聯與洗滌的循環控制
 

　　樹脂溶脹與洗滌
 

　　用二氯甲烷(DCM)溶脹樹脂2小時，抽干后以DMF洗滌3次，去除雜質。
 

　　脫保護
 

　　試劑：40%三氟乙酸/二氯甲烷溶液(含5% TIS作為清除劑)。
 

　　條件：室溫或50℃(含Asp序列需避免高溫，防止Aspartimide形成)。
 

　　監測：通過UV檢測(290nm)確認Fmoc完全脫除(吸光度下降≥95%)。
 

　　偶聯反應
 

　　試劑活化：將氨基酸與HCTU/DIPEA(室溫15-30分鐘)或DIC/Oxyma(90℃下2分鐘)混合。
 

　　投料策略：
 

　　常規序列：5-7.5倍當量氨基酸，分步補投(如初始5倍，UV監測不足時追加2.5倍)。
 

　　困難序列(如連續Pro)：采用“加熱輔助+延長反應時間”(50℃下2次，每次5分鐘)。
 

　　洗滌與封端
 

　　每步反應后用DMF洗滌3次，清除未反應試劑。
 

　　偶聯完成后進行封端反應(如用乙酸酐/DIPEA封閉未反應氨基)。
 

　　數據支持：某抗菌肽合成中，通過優化偶聯條件(5倍當量+50℃加熱)，粗純度從66%提升至84%，試劑消耗降低30%。
 

　　四、裂解與粗肽收集：釋放目標產物
 

　　裂解液配置
 

　　配方：95% TFA + 2.5% 水 + 2.5% TIS(清除劑)。
 

　　預冷至0℃后加入反應釜，攪拌反應2小時。
 

　　產物分離
 

　　裂解液經濾膜抽濾，去除樹脂，并以TFA洗滌樹脂3次，合并濾液。
 

　　濃縮與沉淀
 

　　旋轉蒸發儀濃縮濾液至小體積，加入甲基叔丁基醚(MTBE)沉淀多肽。
 

　　離心(10,000rpm，10分鐘)收集沉淀，用冷乙醚洗滌3次，干燥得粗肽。
 

　　案例：某疫苗多肽合成中，通過優化裂解時間(從3小時縮短至2小時)，產物回收率提升12%，且副產物減少。
 

　　五、純化與凍干：提升產物純度
 

　　高效液相色譜(HPLC)純化
 

　　條件：C18反相柱，流動相A(0.1% TFA/水)，流動相B(0.1% TFA/乙腈)。
 

　　梯度洗脫：0-30分鐘內B相從10%升至60%，收集目標峰。
 

　　凍干處理
 

　　將純化后的多肽溶液旋蒸濃縮，轉移至凍干瓶。
 

　　程序升溫：預凍至-80℃，真空度<50mTorr，升溫至25℃保持24小時。
 

　　數據支持：經HPLC純化后，多肽純度從85%提升至98%；凍干后產物含水量<2%，穩定性顯著增強。
 

　　六、實時監測與數據分析：閉環優化
 

　　UV監測脫保護
 

　　化多肽合成儀記錄每步脫保護的UV吸光度變化，生成脫保護效率曲線。
 

　　凱撒測試(茚三酮測試)
 

　　取10-15個樹脂珠，加入茚三酮試劑后110℃加熱5分鐘，通過顏色變化判斷偶聯完成度。
 

　　數據記錄與報告
 

　　詳細記錄試劑用量、反應時間、溫度、壓力等參數，生成實驗報告。
 

　　案例：某企業通過引入AI算法分析歷史數據，預測合成難點(如β-分支氨基酸區域)，提前調整反應條件，使合成周期縮短40%。